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使用膠原酶的時(shí)候要注意些什么?

更新時(shí)間:2017-04-25      點(diǎn)擊次數(shù):1766
   膠原酶的化學(xué)名為膠原蛋白水解酶(Collagenase),它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu),而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原酶的化學(xué)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì),因此,這對(duì)溫度、PH和導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的各種因素均非常敏感,極易受到外界條件的影響而改變其本身的構(gòu)象和性質(zhì)。
  膠原酶(collagenase)是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的,主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。當(dāng)擬消化的組織較硬,內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時(shí),用胰蛋白酶解離細(xì)胞的效果較差,這時(shí)可采用膠原酶解離細(xì)胞法。 膠原酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。因此適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織,可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為zui終濃度200U/ml(約為1mg/mL)或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞膠原酶,要根據(jù)所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。
  膠原酶的配置
  膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制、消毒滅菌和儲(chǔ)藏。   注意:   因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大,不容易過濾,因此可以用蔡式濾器過濾除菌。   鈣、鎂離子和血清成分不會(huì)影響膠原酶的消化作用,因而可用BSS(如D-hanks或者PBS)或含血清的培養(yǎng)液配制。
  膠原酶的使用
  1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm左右小塊
  2.將組織塊放入離心管(三角燒瓶)中加入30~50倍體積的膠原酶溶液,旋緊蓋子(密封燒瓶)。
  3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內(nèi),每隔3min振搖一次,如能放在37℃的恒溫震蕩水浴箱中則更好。消化時(shí)間與組織的類別很有關(guān)系,對(duì)于某些腫瘤組織或其他較致密結(jié)締組織,消化時(shí)間4~48h,對(duì)于容易消化的組織可以采用37℃震蕩消化15~45min,也可以根據(jù)具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀,一經(jīng)搖動(dòng)即成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞,可以認(rèn)為已消化充分。上皮組織經(jīng)膠原酶消化后,由于上皮細(xì)胞對(duì)此酶有耐受性,可能仍有一些細(xì)胞團(tuán)未*分散,但成團(tuán)的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長,因此,如無特殊需要可以不必再進(jìn)一步處理。
  4.收集消化液(有時(shí)含個(gè)別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網(wǎng)過濾),離心1000r/min,5min,去除上清,用Hanks液或者無血清培養(yǎng)液離心漂洗1~2次,去除上清,加培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種培養(yǎng)瓶。
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